Züchtungskunde, 78, (6) S. 440 – 450, 2006, ISSN 0044-5401
Quantifizierung der mRNA-Expression von Kandidatengenen in Nutzieren mittels qRT-PCR
M.W. Pfaffl und H. H.D. Meyer
Zusammenfassung:
Die molekularen Technologien Genomics, Transcriptomics, Proteomics und Metabolomics erobern immer mehr die klassischen Forschungsgebiete der Agrar- und Biowissenschaften. Die enorme Flut an gewonnenen Daten und Ergebnissen kann von überproportionalem Nutzen in der modernen Tierzucht, molekularen Physiologie, Veterinärdiagnostik und im Rahmen der „Functional Genomics“ sein. Immer neue ausgeklügelte Methoden und Anwendungen sind nötig, um die natürlichen komplexen Stoffwechselwege und physiologischen Vorgänge zu erforschen und zu beschreiben. Da wir uns erst am Anfang dieser molekularen -omics Ära befinden, ist es notwendig, neue molekulare Techniken und Verfahren zu entwickeln, diese zu optimieren und zu validieren, und schließlich auf unsere agrarwissenschaftlichen oder veterinärmedizinischen Fragestellungen anzuwenden. Eine dieser sehr modernen und technisch ausgefeilten Methoden zur zuverlässigen und exakten Quantifizierung spezifischer mRNA stellt die quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) dar. Dieser Review beschreibt im wesentlichen neue Ansätze der mRNA-Quantifizierung von ausgesuchten Kandidatengenen, verschiedene Methoden der relative Quantifizierung, die Normalisierung der Expressionsergebnisse anhand einer oder mehrerer nicht regulierter Referenzgen mRNA-Expressionen, die Berechnung der real-time PCR-Effizienz sowie die Verrechnung und statistische Auswertung der Expressionsergebnisse.
Keywords/Stichworte:real-time PCR, qPCR, RNA-Integrität, Reverse Transkription, Quantifizierungsstrategien,
Normalisierung, Effizienz
Die molekularen Technologien Genomics, Transcriptomics, Proteomics und Metabolomics erobern immer mehr die klassischen Forschungsgebiete der Agrar- und Biowissenschaften. Die enorme Flut an gewonnenen Daten und Ergebnissen kann von überproportionalem Nutzen in der modernen Tierzucht, molekularen Physiologie, Veterinärdiagnostik und im Rahmen der „Functional Genomics“ sein. Immer neue ausgeklügelte Methoden und Anwendungen sind nötig, um die natürlichen komplexen Stoffwechselwege und physiologischen Vorgänge zu erforschen und zu beschreiben. Da wir uns erst am Anfang dieser molekularen -omics Ära befinden, ist es notwendig, neue molekulare Techniken und Verfahren zu entwickeln, diese zu optimieren und zu validieren, und schließlich auf unsere agrarwissenschaftlichen oder veterinärmedizinischen Fragestellungen anzuwenden. Eine dieser sehr modernen und technisch ausgefeilten Methoden zur zuverlässigen und exakten Quantifizierung spezifischer mRNA stellt die quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) dar. Dieser Review beschreibt im wesentlichen neue Ansätze der mRNA-Quantifizierung von ausgesuchten Kandidatengenen, verschiedene Methoden der relative Quantifizierung, die Normalisierung der Expressionsergebnisse anhand einer oder mehrerer nicht regulierter Referenzgen mRNA-Expressionen, die Berechnung der real-time PCR-Effizienz sowie die Verrechnung und statistische Auswertung der Expressionsergebnisse.